主讲老师第三十九课：SNP 数据及其展示方法
随着肿瘤免疫治疗和测序技术的发展，肿瘤突变负荷（Tumor mutation burden，TMB），这个最近研究火热的话题，越来越受到大家的关注。当然，在生信研究中，突变与肿瘤的相关研究也随之兴起，接下来，我们将为大家展示如何使用“maftools”包（maftools.zip）对患者的突变情况进行可视化首先，来看一篇范文文献，题为“Exploration of the relationships between tumor mutation burdenwith immune infiltrates in clear cell renal cell carcinoma”。首先，拆解一下文章题目，推测作者主要是探究了肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma ， ccRCC）中肿瘤突变负荷与免疫浸润之间的相关性，在此结合了突变与免疫两个热点话题。接着，浏览全文，总体看看作者的分析思路，作者展示了 TCGA 数据库中 336 例 ccRCC 患者的整体突变情况，以患者的 TMB 为依据，将样本分为高 TMB 组和低 TMB 组，随后，对两组之间进行了差异分析，比较两组间的表达谱，从批量生存分析中鉴定出 9-HUB-TMB 相关基因，结合 TIMER数据库和 CIBERSORT 算法，评估了 hub-gene 与免疫细胞浸润之间的相关性，最后，作者使用多因素 Cox 回归中构建了肿瘤突变负担预后指数（TMBPI）。在这里，我们主要针对如何对肿瘤突变数据进行可视化展示首先，我们来看看材料与方法的第一部分，“Acquisition of somatic mutation data”（获取突变数据）作者从 TCGA GDC 检索得到了 ccRCC 患者，选择”Masked Somatic Mutation“作为突变数据，使用 R的“ maftools”包进行可视化过程。生信分析，数据先行，分析前，我们简单介绍一下如何在 TCGA GDC下载肿瘤患者的突变数据。
1.数据下载
我们先介绍一下网页在线如何下载突变数据，在后面的内容中，会进一步展示如何使用 TCGAbiolinks进行突变数据的下载。
1).首先，进入 TCGA GDC 网站，点击“Repository”进入数据下载界面2).根据实验方法，在 case 中选择 kidney-TCGA-TCGA-KIRC，在 file 中选择 simple nucleotidevariation-Masked Somatic Mutation。
最终得到四个使用不同方法预处理后的突变文件。点击“Add All Files to Cart”，将文件添加至购物车Cart 中并进行下载。
虽然比较简单，但是需要注意几个内容：
1). Aggregated Somatic Mutation 是包含胚胎 DNA 突变信息的文件，而我们的分析主要基于体细胞突变情况，需要去除胚胎母系 DNA 的突变，因此选择“Masked Somatic Mutation”文件2). 在 Masked Somatic Mutation 中存在 4 个不同方法预处理得到的结果，我们在分析中一般选择varscan 处理得到的结果。
2.引用 R 包
与文章作者一样，我们使用了 R 的 maftools 包，其存在于 Bioconductor 中。
3.数据的读取与查看
因为下载得到的 maf 文件的文件名很长，我们将其重新命名为 TCGA.KIRC.varscan.maf。
在此，我们主要针对突变数据，只读入组学数据，不添加临床数据当然，我们可以使用 getSampleSummary(rt)和 getGeneSummary(rt)分别查看样本信息和基因信息。
4.突变情况的可视化
4.1 summary 图
首先绘制 MAF 文件的整体结果图。
可以发现，当根据不同类别对突变类型进行分类时，错义突变占主要的部分，而且，SNP的出现频率高于插入或缺失，且 C>T 是 SNV 最常见的突变。同时，图中还展示了特定样品中的肿瘤突变负荷以及排名前 10 位的突变基因
4.2 oncoplot 图，或瀑布图
图中展示了排名前 30 位的基因在不同样本中的突变情况，各种颜色表示不同的突变类型，图例上方的小节显示了突变负荷。其中，共有 290 例（86.31%）样本存在基因突变，VNL基因在 ccRCC 患者中的突变频率最高，图的右半部分通过柱形图展示了该基因不同突变类型的占比情况
4.3 Oncostrip 图
除了整体的突变情况外，我们也可以使用 Oncostrip 函数提取其中感兴趣或者研究热点的基因，从而单
独分析特定基因的突变情况
通过 Oncostrip()函数得到了 TTN，mTOR 和 TP53 这三个基因在患者中的突变情况，其 中不同的颜色代表了不同的突变类型。
4.4 转换和颠倒
此外， titv 函数将 SNP 分类为 Transitions and Transversions，并以各种方式返回汇总表的列表，汇总的数据还可以可视化为显示六个不同转换的总体分布的 boxplot 图，以及显示每个样本中的转换分数的堆叠条形图
4.5 Lollipop 图展示氨基酸突变
棒糖图是显示蛋白质结构突变点的简单有效的方法，许多癌基因都有一个优先位点，其突变频率比其他任何位点都要高，这些点被认为是突变热点，棒棒糖图可以用来显示它们和其他突变，我们可以使用函数 lollipopPlot 绘制这样的曲线图。当然，这个函数的使用要求我们在 maf 文件中有氨基酸变化信息，因为在 TCGA 数据库中提供了氨基酸突变情况，而其他的数据集来源的数据并不一定带有氨基酸变化信息
4.6 相关性图
此时，我们得到了不同基因突变之间的相关性热图，颜色代表了相应的 P 值，并对P <0.05 和P <0.001的进行了标记。
5.计算 TMB
接下来，我们来看下当下较热的肿瘤突变负荷。TMB 的定义通常是基因组中每 1Mb 蛋白编码区的平均突变个数，所以我们可以通过 WES 全外显子测序，在去除了胚系 DNA 变异后，将所有突变情况除以人类蛋白编码区长度 MB 即可获得 TMB在文章中，通过查阅材料与方法可知，作者是基于 perl 语言来计算 TMB，当然，maftools包同样提供了 TMB 的计算方法，在此，我们来演示一下如何使用 R 的 maftools 包来计算患者的 TMB。
直接使用 tmb()函数即可完成整个计算过程，注意一下，maftools 包的 tmb()函数去去年更新后出现的，如果安装了旧版本的话，可以更新一下 R 包。当然，在 R 包的更新过程中，作者也删除了部分的旧函数，比如说词云的绘制同时可以把计算得到的结果使用 write.table()函数保存下来，用于后续分析。当然，有的小伙伴可能会问 perl 计算得到的和 R 的 maftool 包计算得到的 TMB 值之间是否存在不同，在此，我进一步计算和比较了两组 TMB 值之间的相关性。
可以看到，无论是通过 perl 或者 R 计算得到的 TMB 结果，两者存在显著的一致性，所以，大家可以放心的使用，进行后续的分析。计算完成后，接下来，我们对其中的棒棒糖图进行个性化讲解，因此直接使用 maftools 包绘制的结果相对比较朴素。